Andrej VidovićNauka

The Human Genome Project: Biološki kontinuum

Prošla je skoro jedna cela decenija od kada je šifra ljudskog života odgonetnuta. Gigantski opseg saradnje i planetarnih napora utro je put prisnijem poznavanju naše prirode, ali i uspešnijem suočavanju sa budućim izazovima. Ovo je povest koja traje, sa srećnim krajem na horizontu.

Ugledni naučni časopis Nature nije propustio da u svoju specijalnu rubriku “Meetings that changed” the world uvrsti i 3. i 4. mart 1986. godine. Bila su to dva dana prvih, dečijih koraka ljudskog genoma na konferenciji u Santa Feu u vidu diskusije o mogućnostima sekvenciranja istog. Iste godine, u laboratoriji Cold Spring Harbor na Long Islandu, u New Yorku, skup naučnika iz celog sveta diskutovao je o daljim mogućnostima da se genetičke informacije ljudskog genoma dekodiraju. Džinovska saradnja postavila je za cilj sekvenciranje DNK svih 24 hromozoma čime su položeni temelji za Projekat ljudskog genoma (Human Genome Project – skraćeno HGP).

Oficijelno započet oktobra 1990. godine, i potpuno završen 13 godina kasnije (iako je isprva bilo planirano da traje 15 godina) HGP, pod rukovodstvom američkog Ministarstva za energetiku i Nacionalnog instituta za zdravlje, za ciljeve je postavio: a) identifikaciju svih gena u ljudskoj DNK (između 20 i 25.000) b) određivanje sekvenci tri milijardi parova baza koje čine DNK c) skladištenje tih informacija u bazu podataka d) poboljšanje alata za analizu podataka d) transfer tehnologija u privatni sektor i e) izjašnjavanje o etičkim i društvenim temama koje izranjaju iz projekta. Paralelne studije, osim onih nad ljudskim genomom, su vršene nad bakterijom Escherichia coli, voćnom mušicom i laboratorijskim mišem kako bi se razvila tehnologija i uspešnije interpretirale funkcije ljudskih gena. Istorijski radovi koji do neophodnih akademskih tančina opisuju postupak sekvenciranja i analiziranja ljudskog genoma prvi put su objavljeni u časopisima Nature i Science, februara 2001. i aprila 2003. godine

To je, ukratko, istorijat čijim ćemo se odlučujućim trenucima vratiti malo kasnije. Sada se moramo osvrnuti na razjašnjenje osnova ljudske genetske građe čime ćemo rasvetliti i epohalni značaj jednog od najvećih kolaborativnih projekata u ljudskoj istoriji.

Šta čini i šta je, uopšte, genom?

Gradacijski gledano, najelementarnija gradivna jedinica ogranizma, ćelija, svoje funkcionisanje duguje instrukcijama koje su uskladištene unutar DNK (dezoksiribonukleinske kiseline) koja je sačinjena od istih hemijskih komponti kod svih živih organizama – četiri baze, adenina (A), guanina (G), timina (T) i citozina (C). Aranžman ovih baza duž DNK lanca (npr., ATCGATTGA) je DNK sekvenca, a redosled baza je, suštinski, tačno uputstvo za kreiranje određenog organizma sa svojim unikatnim osobinama i ključan je za opšti diverzitet života.

Genom je kompletan set DNK u jednom organizmu. Genomi variraju u veličini, od onog koji sadrži svega 600.000 baznih parova do ljudskog, sastavljenog od čak 3 milijarde. Sve ljudske ćelije, osim zrelih crvenih krvnih ćelija, sadrže kompletan genom.

DNK je u ljudskom telu aranžiran u 24 različita hromozoma – visoko organizovane strukture sastavljene od DNK i proteina. Njihova dužina može biti od 50 miliona do 250 miliona baznih parova. Svaki hromozom u sebi nosi mnoštvo gena, specifičnih nizova baza sa kodiranim uputstvima za pravljenje proteina. Geni čine samo 2% ljudskog genoma. Sami proteini su, bez preterivanja, nesumnjivo “glavni igrač” u izvršavanju svih životnih funkcija. Oni su veliki, kompleksni molekuli sačinjeni od manjih jedinica zvanih amino-kiseline. Dvadeset različitih amino-kiselina stvara proteinske lance koji se savijaju u karakteristične trodimenzionalne strukture koje definišu njihovu određenu ulogu u ćeliji.

Konačno, stižemo i do proteoma, vrhovnika genetske hijerarhije ogranizama i konstelacije svih proteina u ćeliji. Proteom je, za razliku od genoma, dinamičan i promenljiv kao odgovor na hiljade unutarnjih i spoljašnjih signala. Grana molekularne biologije i biohemije koja istražuje ponašanje i strukturu proteina, proteomika, biće u središtu pažnje sledećih decenija i pomoći će u razumevanju molekularnih osnova bolesti.

Kako se sekvencira genom

Sekvenciranje DNK je proces utvrđivanja tačnog redosleda 3 milijarde hemijskih baza (A, T, C i G) u DNK u 24 različita ljudska hromozoma. Bio je to najveći tehnološki izazov u Projektu ljudskog genoma. Rezultujuće mape DNK sekvenci unutar otkrivenih 20 – 25.000 gena koriste naučnici XXI veka kako bi uspešnije istraživali ljudsku biologiju i kompleksne fenomene unutar nje.

Standardna metoda za sekvenciranje genoma je bilo razdvajanje DNK fragmenata običnom gel-elektroforezom (procedura kojom se fragmenti razdvajaju po veličini na osnovu naelektrisanja kretanjem u gelu od, npr., agaroze). Bila je vrlo mukotrpna i skupa, ali je vremenom napredovala – tokom 1998. godine sekvencirano je 200 miliona baznih parova, a samo u januaru 2003., jedan institut je sam sekvencirao 1,5 milijardi baza za jedan mesec.

Gel-elektroforeza

Evo tačne procedure sekvenciranja genoma po koracima kako su predočeni na zvaničnom sajtu HGP-a: Reč je, suštinski, o replikaciji DNK. Najpre se hromozomi razbijaju u mnogo kraće delove, a svaki od njih se zatim koristi kao šablon kako bi se generisao set fragmenata koji se međusobno razlikuju u dužini za jednu bazu, koja je fluorescentno obeležena, a koja se kasnije identifikuje. Fragmenti se odvajaju gel elektroforezom, a dobijene fluorescentne boje omogućuju separaciju sva četiri fragmenta u jedom redu u gelu. Poslednja baza na kraju svakog fragmenta je identifikovana – ovim procesom se ponovo kreira originalna sekvenca A, T, C i G baza za svaki kratak deo generisan u prvom koraku. Aktuelna ograničenja elektroforeze su oko 500 do 700 sekvenciranih baza po čitanju. Nakon što su baze pročitane, kompjuteri slažu kratke sekvence u duge, kontinuirane nizove koji se analiziraju na greške, samokodirajuće regione i drugo.

Završena sekvenca se prosleđuje glavnim javnim bazama sekvenci i na taj način se čini dostupnom svima na svetu.

Praktična primena i etička pitanja

U projektu ljudskog genoma primarnih pet učesnika su bili “Sanger centar”, “Whitehead institute”, Centar za sekvencioniranje genoma Univerziteta Vašington, “Baylor College of Medicine” i “DEO Joint Genome Institute” (uz ostalih četrdesetak sa sedištima, mahom, širom razvijenih zemalja sveta). Svih pet centara su bili podređeni stvaranju izvora znanja koji će izdržati test vremena. Pedantnost sa tim ciljem u vidu sa kojom su pristupili završnom doterivanju finalne sekvence je dovela do toga da ona ima procenjenu mogućnost jedne greške tek na svakih 100.000 baza.

Krajem 2001. godine i većim delom 2002., kada je već postalo jasno da će projekat ubrzo biti okončan ranije nego što je predviđeno, i to uz manje troškove od projektovanih, Nacionalni institut za istraživanje ljudskog genoma je okupio vodeće naučike na dva velika otvorena stola pod nazivom “Beyond the Beginning: The Future of Genomics I and II”, kojom prilikom je održana radionica sa idejom da se razluče i izkristališu pojedine tačke o politici, edukaciji i etici genomike.

Od 3 do 5% budžeta za istraživanje genoma je izdvajano za potrebe proučavanja etičkih, zakonskih i društvenih tema i implikacija koje bi jedno ovakvo otkriće iziskivalo – pre svega polazeći od pitanja poput “Ko sme da ima pristup ličnim genetskim informacijama?”, “Ko poseduje i kontroliše genetske podatke?”, “Kako lični genetski profil može da utiče na viđenje dotične individue od strane društva?”…Pod-projekat ELSI (Ethical, legal and social issues) je, sa bremenom dostupnosti genetskih informacija, u svojim rukama držao ključ za opštu zabrinutost za njihovu fer upotrebu, privatnost i diskreciju, psihološki uticaj i stigmatizaciju, pitanja reprodukcije, kliničke teme (edukacija lekara ali i pacijenata), konceptualne i filozofske implikacije (poput pitanja “Šta se smatra prihvatljivim diverzitetom?” ili “Mogu li ljudi uvek kontrolisati svoje ponašanje?”), zadatke koji se tiču genetski modifikovane hrane…

Kraj? Ne – samo kraj početka

Iako ima već devet godina od kada je i službeno, uspešno okončan, projekat ljudskog genoma je zapravo okrilje novih, budućih priča naučnog preduzetništva pre nego zatvaranje poglavlja u istoriji nauke. Smisleni zaključci izvučeni iz dešifrovanih desetina hiljada gena doneće uticaj na biološke pristupe lečenju kakav je nemoguće opisati. Proučavanju svakog gena sada se može prisupiti sistematičnije i na većoj skali – ovaj levijatanski naučni prodor je, na primer, doveo do toga da je moguće kako svi geni i proteini rade zajedno u međupovezanim mrežama i velikom hemijskom orkestru života.

Osnovni izazov našeg veka biće pojedinačno ispitivanje svakog ljudskog gena i utvrđivanje efekta njihove mutacije na pojavu bolesti. Doći će do produbljivanja terapija na genetskoj osnovi, stvaraće se nove klase lekova odgovarajuće spravljenim po receptima i građi gena i proteina, tačno namenjene određenim mestima u organizmu što će neželjene nuspojave svesti na minimum. Funkcionalna genomika – polje molekularne biologije koje ogromnu količinu podataka koju su obezbedili projekti sekvenciranja genoma koristi radi studija genetskih funkcija na velikim skalama – obuhvataće studije u transkriptomici (analiza informacione RNK aktivnih gena), proteomici (proučavanje funkcije i ekspresije proteina što takođe može imati implikacije na dizajn lekova), strukturalnoj genomici (generisanje 3D struktura jednog ili više proteina kako bi se kvalitetnije dizajnirali lekovi) i komparativnoj genomici (analiziranje šablona DNK sekvenci ljudi i drugih organizama uporedo).


Ključne figure Projekta ljudskog genoma

Iako je HGP bio kolektivan poduhvat, postoje individue i institucije koje su se istakle u trci za konačnim kompletiranjem genoma. Tako je jedna od najbitnijih osoba bila američki biolog i istraživač Craig Venter, takođe i šef privatne firme “Celera Genomics”. On je koristio drugačiju tehniku od uobičajenih (whole genome shotgun sequencing) a ukupan fond njegovog projekta je bio 300.000.000 dolara i očekivalo se da će teći brže od zvaničnog. “Celera Genomics” je koristila DNK petoro pojedinaca, a kasnije je i sam Venter obznanio da je njegova DNK bila među 21 uzoraka, od kojih je tih pet izabrano.

Pored Ventera, apsolutno nezamenljivu ulogu u HGP-u su imali Eric Lander, direktor Whitehead instituta, jedne od tri velike laboratorije koje su dale najveći doprinos uspehu projekta, John Sulston, šef Sanger centra i možda vodeća figura u HGP-u i Francis Collins, direktor Nacionalnog istraživačkog instituta za ljudski genom koji je finansirala vlada SAD.

Činjenice o ljudskom genomu

  • Ljudski genom se sastoji od 3164.7 miliona hemijskih nukleotidnih baza (A, C, T i G).
  • Prosečan gen sadrži 3000 baza – najveći gen je za protein distrofin koga sačinjava 2,4 miliona baza.
  • Ukupan broj gena je između 20 i 30 hiljada. Skoro sve nukleotidne baze (99,9%) su iste kod svih ljudi.
  • Još uvek je nepoznata funkcija oko 50% otkrivenih gena.
  • Ponavljane sekvence koje ne kodiraju za proteine – tzv. “junk DNA” – čini makar 50% ljudskog genoma. Manje od 2% DNK kodira za proteine.
  • Hromozom 1 ima najveći broj gena (2968), dok polni hromozom Y ima najmanje (231).
  • Ljudski genom ima prilično nejednaku distribuciju oblasti bogatih genima, dok mnogi drugi organizmi imaju genome koji su mnogo uniformniji, sa ravnomerno raspoređenim genima.
  • Ljudi dele većinu proteinskih familija sa crvima, muvama i biljkama, ali se količina genskih familija povećala kod ljudi, pogotovo u proteinima uključenim u razvoj i imunitet.
  • U delovima ljudskog genoma koji su bogati genima je prisutno više GC parova nukleotida.
  • Suprotno tome, delovi siromašni genima su bogati gradivnim blokovima A i T. Regioni koji obiluju GC i AT parovima nukleotida mogu biti viđeni kroz mikroskop u vidu tamnih traka na hromozomima.

autor: Andrej Vidović